Identificación y caracterización molecular de la microbiota de Meloidogyne spp. asociada al cultivo de espárrago (Asparagus officinalis L.) en la provincia de Virú – La Libertad

Abstract

El presente trabajo de investigación se desarrolló en los laboratorios del Centro de Investigaciones Biotec CMC – Tumbes desde noviembre del 2012 hasta febrero del 2013. Esta investigación se realizó con la finalidad de identificar y caracterizar las bacterias endosimbiontes de Meloidogyne spp. a nivel molecular. Como primera etapa se realizó el aislamiento de nematodos noduladores de forma individual, tanto del suelo como de las raíces por extracción directa de forma manual o por el método de Baerman modificado, con la obtención de nematodos noduladores individuales se procedió con la siguiente etapa de extracción de bacterias endosimbiontes, y en paralelo se ejecutó la identificación molecular de los nematodos noduladores a nivel de género realizando la extracción de ADN directamente desde la raíz, que resultó ser sencilla y práctica, y un análisis bioinformático de la región 18S rRNA. Para la extracción de bacterias endosimbiontes, se desinfectaron los nematodos del segundo estadio con alcohol al 50% dentro de un microtubo, seguido de seis lavados con buffer M9, 30 minutos en reposo de la muestra con cloruro de sodio al 2%, para luego romper los nematodos con ayuda de perlas de vidrio mediante la acción de un vortex. El producto obtenido en la extracción de bacterias fue sembrado en los medios de cultivo Agar nutritivo y PDA con antibiótico, se realizaron aislamientos de las colonias bacterianas obtenidas para ser purificadas, como resultado se obtuvieron ocho cepas bacterianas diferentes. Se extrajo ADN de cada cepa y se replicó el ADN por PCR, para luego realizar la secuenciación nucleotídica, seguida del análisis que determino el género de las cepas: 2-M y 28-M del género Bacillus, las cepas 25-M, 26-M y 27-M del género Acinetobacter, y las cepas 3-M, 21-M y 22-M del género Pseudomonas. Posteriormente se realizó un análisis bioinformático de la región del gen 16S rRNA para la VII caracterización de todas las cepas bacterianas mediante árboles filogenéticos elaborados en el software Mega 5.05, con un análisis comparativo de 10000 posibles árboles. Palabras