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Caracterización molecular de la microbiota bacteriana y fúngica de hojas sanas y con síntomas de enfermedades de manchas foliares de banano mediante técnicas dependientes e independientes de cultivo
(Universidad Nacional de Tumbes, 2024) Mogollón Farias, César Augusto; Mialhe Matonnier, Eric
Las enfermedades de manchas foliares del banano son un serio problema para la industria del banano. Las enfermedades causadas por las manchas foliares del banano están asociadas a un complejo de hongos patógenos, de los cuales sigatoka es considerada la enfermedad foliar más devastadora del cultivo de banano, causado por el hongo Pseudocercospora fijiensis responsable de la necrosis de las hojas del banano. En el presente estudio, un enfoque de metagenómica dirigida y comparativa ha sido aplicado para caracterizar las comunidades bacterianas y fúngicas en la filósfera a partir de hojas de plantas con ausencia y presencia de síntomas de enfermedades de manchas foliares. Bacterias y hongos han sido aisladas e identificadas molecularmente basadas en la secuencia parcial del gen ADNr 16S y ITS. La clasificación taxonómica revelo cuatro y nueve Fylum bacterianos conocidos en tejidos de hojas con ausencia y presencia de síntomas respectivamente. El análisis de las comunidades bacterianas reveló 110 OTUs de bacterias. La microbiota bacteriana en hojas sanas fue compuesta principalmente con Zymobacter que estuvo presente solo en hojas sanas, seguido de Pantoea y Bacillus. En hojas de plantas con síntomas los géneros más representativos fueron Bacillus, Halospirulina y Erwinia, mientras Rubritepida estuvo presente solo en plantas enfermas. La diversidad fúngica de plantas enfermas reveló 63 OTUs, con los géneros Cladosporium y Alternaria como los más representativos y Pseudocercospora antes conocido como Mycosphaerella siempre estuvo presente en hojas de plantas enfermas. Nuestros resultados demuestran que gracias los análisis metagenómicos permite entender las relaciones entre las comunidades microbianas y fúngicas en el microbioma foliar y proporcionar posibles estrategias de control biológico de las enfermedades de manchas foliares del banano.
Caracterización molecular de bacterias nitrificantes heterotróficas aisladas de sedimentos de estanques en un cultivo RAS-BIOFLOC de Litopenaeus vannamei a baja salinidad
(Universidad Nacional de Tumbes, 2024) Borja Caicedo, Jorge Isaac; Cedeño Escobar, Virna Alexia
La acuacultura intensiva conlleva a riesgos de cultivo principalmente la acumulación de amoniaco y nitrito altamente tóxicos para la población en crianza. La nitrificación heterotrófica ha tomado relevancia en los últimos años principalmente por sus altas tasas de remoción. El objetivo de este trabajo fue caracterizar molecularmente bacterias nitrificantes heterotróficas aisladas de sedimentos de un cultivo súper intensivo híbrido RAS-BIOFLOC de L. vannamei a baja salinidad. El aislamiento se realizó en medios específicos de nitrificación heterotrófica con amonio y nitrito a concentraciones de 10 mg/L. La PCR fue empleada para la amplificación de genes funcionales amoA, nxrB y el universal ARNr 16S el cual fue sometido a secuenciación de Sanger, los datos fueron analizados mediante Bioedit, Blast y Mega-X. Se logró el aislamiento de 21 cepas de las cuales CBM3, CBM12 y CBM16 mostraron capacidad de remoción de amonio con tasas de nitrificación de 1,95, 0,31 y 0,50 mg/L por hora, respectivamente. Mientras que la remoción de nitrito por CBM17, CBM18 y CBM21 fue de 0,63, 0,58 y 0,28 mg/L por hora, respectivamente. Las cepas CBM10 y CBM14 mostraron capacidad de nitrificación completa con tasas de remoción de amonio de 0,83 y 0,42 mg/L por hora y nitrito 1,25 y 0,83 mg/L por hora, respectivamente. Se comprobó mediante PCR la presencia de genes amoA y nxrB en los aislados. Las ocho cepas nitrificantes fueron identificadas como: Acinetobacter harbinensis (CBM3), Pseudomonas baleárica (CBM10), P. stutzeri (CBM12), P. taiwanensis (CBM14), Enterobacter cloacae (CBM16), P. nitroreducens (CBM17), P. putida (CBM18) y Bacillus amyloliquefaciens (CBM21). Se estableció un consorcio CNH12 conformado por CBM3, CBM10, CBM12, CBM14, CBM17 y CBM18 con tasa de nitrificación de amonio y nitrito de 3,3 y 2,5 mg/L por hora, respectivamente. Estos hallazgos sugieren que CNH12 tendría un uso potencial en la eliminación biológica de nitrógenos en sistemas acuícolas.
Análisis metagenómico de la abundancia y persistencia de bacterias y microalgas probióticas inoculadas en un cultivo RAS-BIOFLOC a baja salinidad, en agua e intestino de Litopenaeus vannamei
(Universidad Nacional de Tumbes, 2024) Arroyo Landazuri, Elsie Ela; Cedeño Escobar, Virna Alexia
La intensificación del cultivo de Litopenaeus vannamei es posible integrando sistemas de recirculación de agua (RAS) con biofloc para mejorar la calidad del agua y aportar valor nutricional. Sin embargo, la proliferación aleatoria de microorganismos no garantiza resultados reproducibles. Este trabajo tuvo como objetivo analizar por metagenómica la abundancia y persistencia de bacterias probióticas y microalgas inoculadas en un cultivo RAS-BIOFLOC a baja salinidad con fases Cría (fC), Levante (fL) y Engorde (fE). El biofloc fue formulado con seis bacterias (Bacillus subtilis, B. subsps. subtilis, B. subsps. inaquosorum, B. cereus, B. cereus ATCC14579 y B. lincheniformis) y diez microalgas (Thalassiosira weissflogii, T. pseudonana, Chaetoceros gracilis, C. calcitrans, Navicula cryptocephala, N. glaciei, N. Perminuta, Ghomphoneis minuta, Isochrysis galbana y Pavlova gryans). Se muestrearon intestinos y agua antes de la siembra de larvas (aS) y al final de cada fase. Las bacterias y microalgas inoculadas persistieron, en agua e intestino durante el cultivo. Los intestinos aS revelaron un 1,5% de las bacterias inoculadas y un predominio de las microalgas C. calcitrans (55,2%), T. weissflogii (15,9%), C. gracilis (13%) y T. pseudonana (10,7%). B. subtilis mostró la abundancia relativa más alta en agua (aS: 6,6%; fL: 11,6%; fE; 14,2%) e intestino (fC 12%; fL; 14,3% y fE; 15,3%) seguida por B. subs. subtilis, (5,8±0,8% y 7,9 ±0,5%) las restantes cepas por debajo del 4%, excepto fC donde predominaron especies nitrificantes Pseudomonas (28,8%). Las microalgas más abundantes en agua fueron G. minuta (41,5±3,1%), N. perminuta (27±2%) y T. weissflogii (11,8±2,9%) y en intestinos N. perminuta (36,1±9,4%), I. galbana (21,4±3,5%), G. minuta (19,3±8,3%) y las restantes especies por debajo del 6%. Los resultados sugieren que las bacterias B. subtilis, B. subsps. Subtilis y las microalgas G. minuta, N. perminuta, T. weissflogii e I. galbana son buenas candidatas para inoculaciones de sistemas RAS-BIOFLOC a baja salinidad.
Aplicación de biotecnologías “ómicas” para la caracterización y evaluación de bacterias y microalgas domesticadas de biofloc en cultivo super-intensivo a baja salinidad de Litopenaeus vannamei y con recirculación de agua
(Universidad Nacional de Tumbes, 2023) Lajones Ruano, Gorky Vladimir; Solís Castro, Rosa Liliana
El biofloc es un suplemento conformado por microalgas, bacterias y otros agregados como restos de alimento y heces, los cuales sirven como alimento y ayudan a mejorar la calidad del agua en el cultivo evitando que compuestos nitrogenados como Nitrógeno total amoniacal (TAN), nitrito (NO2 - ) y nitrato (NO3 - ) causen toxicidad a los langostinos. En esta investigación se realizó la adaptación de bacterias y microalgas obtenidas de cultivo de alta salinidad (33 ‰) para evaluar su crecimiento en el cultivo super intensivo de baja salinidad (0-5 ‰). Se utilizó la metagenómica para la caracterización y evaluación de microalgas y bacterias presentes en el cultivo a baja salinidad de L. vannamei. La evaluación de los microorganismos se realizó en baldes (P) y en tanques (M) del módulo de cultivo de langostinos en fase de precría, estadio pl15 con un peso aproximado de 0,0012 g. El análisis metagenómico demostró la presencia de los siguientes géneros bacterianos en “P”: Cetobacterium 44%, Mycobacterium 12%, Bacillus 12%, Clostridium 12%, Peptostreptococcus 9%, Methylosinus 6%, Caldilinea 2%, Rhizobium 2%; y en M estuvieron presentes los géneros Lawsonia 25%, Oscillatoria 22%, Pseudomonas 19 %, Bacillus 14%, Planctomycetes 5%, Rhodobacter 10%, Brevinema 2%, Hymenobacter 2%, Luteolibacter 1%. A nivel de microalgas se observó en P: Fottea 24%, Spumella 5%, Rhodomonas 4%, Amphora 2%, entre otros en menor porcentaje (<1 %); mientras que en M: Cyclotella 20%, Synedra 16%, Desmodesmus 10%, Nitzschia 5%, Scenedesmus 4%, Amphora 3%. Esta investigación permitió determinar la abundancia de los microorganismos presentes en el cultivo L. vannamei a baja salinidad. Los resultados obtenidos demuestran que gracias a los análisis metagenómicos se ha logrado determinar la abundancia de microorganismos presentes en el agua de cultivo de langostino a baja salinidad.
Caracterización molecular de bacterias degradadoras de quitina de pluma de pota (Dosidicus gigas) utilizadas en la producción de metabolitos
(Universidad Nacional de Tumbes, 2022) Navarro Purizaga, Maritza Yliana; Mialhe Matonnier, Eric Louis
La pluma de pota es un residuo de alto valor por contener β‐quitina en su estructura, de la cual se puede obtener diversos metabolitos. El objetivo de la presente investigación fue caracterizar molecularmente bacterias degradadoras de quitina de pluma de Dosicidus gigas utilizadas en la producción de metabolitos. Se realizó un análisis de metagenómica a la pluma de pota. Las bacterias fueron obtenidas del residuo de la pluma de pota y seleccionadas en agar quitina coloidal 1%. La identificación molecular de las bacterias se realizó mediante PCR del gen 16S ARNr, y los productos fueron secuenciados e identificados utilizando la base de datos del BLAST (NCBI) y EzBioCloud. Se identificaron 6 bacterias de las especies Serratia liquefaciens, Celullomonas flavigena, Stenotrophomonas maltophilia y Paenibacillus illinoisensis. Se evaluó la eficiencia y el tamaño de halos de hidrolisis en agar quitina coloidal 1%, siendo C. flavigena la más eficiente y la que presentó mayor halo de hidrolisis seguida de P. illinoisensis, ambas cepas fueron las únicas en producir amilasas. S. maltophilia presentó la mejor actividad lipolítica y amilolítica en comparación con las demás cepas. Mediante PCR end point se identificó la presencia de los genes chiA, schiA, schiB y schiC, que codifican para quitinasas. S. liquefaciens presentó el gen ChiA. Los genes schiB y schiC fueron identificados en S. maltophilia. P. illinoisensis sólo presentó el gen schiC, mientras que C. flavigena no presentó los genes evaluados. Entre los once tratamientos considerados en la degradación de la quitina de pluma de pota para la obtención de metabolitos el tratamiento individual con Paenibacillus illinoisensis (0.156 µmol/min) presentó la máxima actividad quitinasa y producción de quito-oligómeros a las 24 h de evaluación a un pH 6.20. Los espectros analizados por FTIR demostraron que la quitina fue parcialmente modificada por la actividad enzimática de las bacterias seleccionadas.
Detección por cultivo, identificación molecular y “Shotgun proteomic” de Perkinsus sp. en Argopecten purpuratus “concha de abanico” (Lamarck, 1819) y Anadara tuberculosa “concha negra” (Sowerby, 1833)
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Zavala Arellano, Jóselyn Marilyn; Benoit Diringer
Los protozoarios del género Perkinsus sp. son patógenos invasivos, responsables de mortalidades masivas de diversos moluscos bivalvos, y generan grandes pérdidas económicas. Hasta la fecha, los métodos de diagnóstico son limitantes en término de rapidez, sensibilidad y especificidad. El objetivo de este estudio fue detectar e identificar Perkinsus sp. en bivalvos de origen silvestre con importancia económica y social: Argopecten purpuratus y Anadara tuberculosa mediante técnicas alternativas, más sensibles y rápidas. Se colectaron 129 individuos de A. purpuratus y 138 de A. tuberculosa en el transcurso del 2017- 2018. El diagnóstico preliminar de Perkinsus sp. sp fue realizado mediante la observación microscópica de hipnosporas en branquias incubadas en el medio tioglicolato fluído (RFTM), mientras que la identificación taxonómica fue realizada a nivel molecular por PCR. En paralelo se evaluó un nuevo método de diagnóstico basado en la detección de proteínas de Perkinsus sp. mediante “Shotgun proteomic”. La prevalencia de Perkinsus sp. fue 13,95% en A. purpuratus y 21,7% en A. tuberculosa. Los individuos de A. purpuratus mostraron niveles de infección de muy leves a moderados, mientras que fueron únicamente muy leves en A. tuberculosa. Los análisis moleculares basados en la secuenciación del ITS permitieron identificar a P. chesapeaki en A. purpuratus y P. beihaiensis, así como, P. chesapeaki en A. tuberculosa. El diagnóstico por shotgun proteomic concordó al 100% para las muestras de A. purpuratus y al 73.3% para A. tuberculosa con muestras previamente diagnosticadas por RFTM. De estas muestras se identificó 23 fragmentos distintos de péptidos pertenecientes a Perkinsus sp.. El 60.8% de estos péptidos provienen de proteínas codificadas por Perkinsus sp. pero con funciones desconocidas mientras que las demás intervienen en procesos biológicos conocidos. Este trabajo constituye el primer reporte de Perkinsus sp. en moluscos bivalvos en el Perú.
Aislamiento y caracterización molecular de Schizochytrium sp, (Labyrinthomorpha, Thraustochytridae) del manglar de Tumbes y su evaluación como aditivo alimenticio en la dieta del langostino Litopenaeus vannamei
(Universidad Nacional de Tumbes, 2016) Solano Curay César Agusto; Quimi Mujica Juan Gerardo
Los thraustochytridos son protistas marinos de gran importancia por su producción de biomasa y lípidos ricos en PUFAs omega-3 como DHA importantes en la salud, nutrición y prevención de enfermedades en humanos y animales. En la presente investigación se aisló una cepa de thraustochytrido en un medio modificado para el cultivo de Schizochytrium limacinum. Mediante la microscopía invertida y confocal se observó la viabilidad, pureza, crecimiento de células y contenido lipídico de los thraustochytridos. Se identificó molecularmente mediante el gen del ADNr 18S al organismo Schizochytrium sp. Adicionalmente, por espectrometría de masas MALDI TOF/TOF, se identificaron una sintetasa de ácido graso de tipo 1 y una desaturasa delta-4, enzimas de síntesis de lípidos características de Schizochytrium sp. En los ensayos in vivo se usó 1 % de biomasa de Schizochytrium sp. y 25 % de ensilado de pescado como aditivos en la dieta de larvas de Litopenaeus vannamei, mostrando un incremento significativo de 15 % crecimiento y 20 % supervivencia en comparación al tratamiento control. Esta investigación ha abierto el camino relacionado a la inmunonutrición en langostino utilizando thraustochytridos, ampliando a estos microorganismos las numerosas aplicaciones de las técnicas de proteómica y lipidómica mediante la espectrometría de masa MALDI TOF/TOF.
Edición genómica en el “langostino blanco” Litopenaeus vannamei mediada por el sistema CRISPR/Cas9 dirigida al gen LvYY1 implicado en la infección del virus de la mancha blanca
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Esquén Bayona, Dámaris Adelaida; Mialhe Matonnier, Eric Louis
La producción del langostino Litopenaeus vannamei representa grandes beneficios socioeconómicos a muchos países tropicales, sin embargo, es afectado por el devastador virus de la mancha blanca WSSV. Estrategias como inmunoestimulantes, probióticos y mejoramiento genético han sido exploradas, pero deben ser usadas continuamente o requieren de mucho tiempo. Por lo cual, el objetivo de este estudio es inducir mutaciones mediante el sistema CRISPR/Cas9 en genes de Litopenaeus vannamei que median la infección viral. Se seleccionó el gen LvYY1, un factor de transcripción que es usado por el promotor ie1 de WSSV para expresar proteínas virales. LvYY1 fue parcialmente caracterizado evidenciando cinco exones y cuatro intrones. En este estudio desarrollamos un acondicionamos métodos de transfección de células musculares, embriones y espermatocitos que pudieron ser detectados eficientemente por microscopia confocal y espectrometría de masas. Así también implementamos la tecnología de edición genómica CRISPR/Cas9 obteniendo valores de 45-72% de eficiencia de edición en células musculares, 1.4 en espermatocitos y 2.16% en embriones. Las proteínas modificadas (indel y sustituciones) mostraron mediante docking molecular estar truncadas o tener menos afinidad a ie1 que el control. La generación de langostinos con mutaciones en este gen podría inducir a la resistencia al virus de la mancha blanca y apoyar el establecimiento de programas de mejoramiento genético moderno que conduzcan a mejorar la producción del cultivo de langostino Litopenaeus vannamei.
Análisis metagenómico para la identificación de marcadores moleculares en genes de interés y el microbioma intestinal mediante dietas basadas en salicornia y cactus en Capra hircus
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Sucapuca Santos, Gabriela Raquel; Mialhe Matonnier, Eric Louis
La metagenómica es una nueva tecnología de la ciencia del sistema ómico, además tiene amplias aplicaciones. El objetivo de este estudio es identificar el polimorfismo de nucleótido simple (SNP) en el gen cárnico, Diacylglycerol Acyltransferase (DGATP), gen responsable de la conformidad cárnica en caprinos. Por otro lado, la identificación del micriobioma intestinal de cabras y cabritos alimentados con dietas basadas en salicornia y cactus; utilizando la técnica de Secuenciación de próxima generación(NGS). El primer componente se trabajó con 70 animales, las muestras de sangre fueron tomadas de la vena yugular posteriormente se realizó la extracción de ADN, seguido de la reacción en cadena de la polimerasa con primers específicos para el gen DGATP; luego el NGS para la identificación de SPNs, utilizando la plataforma online CRISPRESSO 2. El segundo componente se trabajó con tres tratamientos, cada uno conformado por dos animales (cabra y cabrito); estos fueron alimentados 30 días con cactus, salicornia y alimento tradicional, se realizó la extracción del ADN metagenómico a partir de muestras de heces, utilizando el kit Quick-DNA TM Fecal/Soil Microbe Miniprep. La secuencia NGS fue procesada con el software bioinformático QIIME versión 1.9.1. Lográndose identificar 13 lecturas con variación A/G en la secuencia CCCAGGAA en hembras y 24 lecturas con la misma variación en machos. Por otra parte en el análisis metagenómico de la microbiota intestinal se logró identificar a nivel de Phylum a Firmicutes, y a nivel de Orden Clostridiales con una abundancia de 62.5% y 60.8% respectivamente en cabritos alimentados con cactus; a nivel de Genero Ruminococcaceae en cabras alimentados con salicornia. Nuestros resultados indican que la técnica NGS, es una alternativa para identificación de SNP, así como también la caracterización taxonómica y funcional de las comunidades microbianas en la ganadería caprina.
Identificación molecular, caracterización proteómica y evaluación experimental de la patogenicidad de una cepa de Lactococcus garvieae aislada de tilapia nilótica Oreochromis niloticus en un evento natural de mortalidad en la Amazonía peruana
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Zatán Valdiviezo, Adrian Edú; Motte Darricau, Emmerik
Un evento de mortalidad natural de tilapia nilótica en la laguna El Sauce, región San Martin, Perú, fue observado en el mes de noviembre del 2018. Una cepa bacteriana (L3-1 PB) fue aislada a partir de las lesiones en la piel de dos ejemplares de tilapia. Basados en la secuenciación del gen 16S ADNr y análisis filogenético, el aislado fue identificado como Lactococcus garvieae, y confirmado mediante la reacción en cadena de la polimerasa PCR utilizando cebadores específicos. Para demostrar la patogenicidad de la cepa, se realizó una infección experimental mediante inyección intraperitoneal con la bacteria (4.8𝑥106 UFC/ml), causando una mortalidad acumulada del 50 %. Por otro lado, mediante la técnica de espectrometría de doble masa MALDI TOF-TOF se identificó secuencias de aminoácidos correspondientes a diversos factores de virulencia. Estos resultados sugieren que L. garvieae fue uno de los agentes causales de mortandad en la laguna El Sauce. Este es el primer reporte de L. garvieae en el Perú, donde el cultivo de tilapia continua en expansión, por lo tanto, es de suma importancia monitorear y proteger a esta especie de diversos agentes infecciosos.
Aplicación de tecnologías ómicas al estudio de las comunidades microbianas nitrificantes y desnitrificantes para la obtención de biofiltros sumergidos y su evaluación a nivel experimental en el cultivo intensivo de Litopenaeus vannamei
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Dominguez Mendoza, Luz Fernanda; Cedeño Escobar, Virna Alexia
La acumulación de nitrógeno (-N) es un problema grave en el cultivo intensivo de Litopenaeus vannamei ya que está asociado a eventos de mortalidad masiva. En el presente estudio, se evaluó el efecto del uso de biofiltros sumergidos sobre los niveles de -N y la supervivencia de langostino en un cultivo intensivo experimental durante 60 días sin sifoneos y sin recambios de agua. Los biofiltros fueron previamente enriquecidos; a) Usando un protocolo de enriquecimiento para la obtención de biofilm nitrificante o b) Usando un consorcio de bacterias heterotróficas nitrificantes caracterizadas a nivel molecular. Durante el enriquecimiento, se evaluó el efecto de la fuente de carbono en la eliminación biológica del nitrógeno. En el enriquecimiento con bicarbonato de sodio el nitrógeno amoniacal total (TAN) fue removido con una eficiencia de 96.04 ± 1.16% y el análisis metagenómico reveló que el perfil taxonómico estuvo dominado por el phylum Proteobacteria (51.37%) y Bacteroidetes (9.72%). Además, se observó un aumento de 0,41% a 2,80% en la abundancia relativa del phylum Nitrospirae. Para la obtención de bacterias heterotróficas nitrificantes se evaluó la capacidad de nitrificación heterotrófica de 8 cepas aisladas a partir de suelo de manglar, perifitón y biofiltros. Las cepas seleccionadas fueron Bacillus megaterium, Bacillus haynesii, Bacillus wiedmannii y Bacillus tequilensis en las cuales se identificaron mediante PCR regiones específicas de los genes nxrB, nirS y nirK y mediante espectrometría de masas MALDI TOF TOF se identificaron enzimas claves en los procesos de nitrificación/desnitrificación reportándose por primera vez las enzimas tipo amoniaco monoxigenasa (AMO) y nitrito óxido reductasa (NXR) en el género Bacillus. En los tanques con biofiltros la calidad del agua fue óptima y los níveles de TAN y nitrito fueron más bajos respecto al control (sin biofiltro). La supervivencia en los tanques con biofiltros fueron de 96.67% y 98.33%, mientras que en el control fue de 30.00%. En los biofiltros enriquecidos con el consorcio bacteriano se identificaron enzimas relacionadas a los procesos de nitrificación/desnitrificación y metabolismo del fosfato y azufre. Los resultados 8 del presente estudio abren nuevas vías para futuras investigaciones aplicando las tecnologías ómicas al estudio de las comunidades microbianas involucradas en los ciclos del nitrógeno, fósforo y azufre para la biorremediación en la acuicultura.
Identificación molecular de la diversidad bacteriana intestinal de Hermetia illucens (Stratiomyidae-Diptera) mediante técnicas independientes, dependientes y espectrometría de masas Maldi tof/tof
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Casariego Oblea, Jimena Lizbeth; Mialhe Matonnier, Eric Louis
La necesidad de aumentar la sostenibilidad en la agricultura, para garantizar la seguridad alimentaria de las generaciones futuras, está dando lugar a la aparición de instalaciones de cría industrial para insecto. Hermetia illucens ha recibido una mayor atención científica por su potencial en el manejo de los residuos, donde las larvas de este insecto pueden servir como alimento para peces, aves y ganado, además de la obtención de biodiesel, su valor científico y comercial de las larvas de H. illucens ha aumentado recientemente, por lo que es necesario enfocarse en la masificación de dicho insecto. En este estudio, presentamos una identificación a profundidad de la microbiota intestinal de H. illucens usando tecnicas independiente, dependientes de medio de cultivo con la secuenciación de alto rendimiento del gen 16S rRNA y la Espectrometría de Masas MALDI TOF/TOF, e informar la presencia de bacterias que ayudan en la degradación y oviposición de H. illucens. Ochenta y siete unidades taxonómicas operativas (OTU) se identificaron desde el intestino larvario. Las OTU representaban 5 phyla, 10 clases, 18 órdenes, 27 familias y 50 géneros. La mayoría de las OTU bacterianas pertenecían al Orden Enterobacteriales, que era el taxón más abundante en el intestino larvario. Las bacterias cultivables revelaron once OTU que pertenecían a Gammaproteobacteria. Posteriormente, examinamos a nivel de proteínas mediante la Espectrometría de Masas MALDI TOF/TOF revelaron 61 secuencias peptidicas presentes en tracto digestivo de H. illucens, bacterias que ayudan en la degradación y oviposición. Nuestro estudio proporciona la primera identificación de la diversidad microbiana intestinal de las larvas, mediante técnica moleculares direccionada fuertemente a nivel de la metagenómica, genómica y Proteómica, mostrando que algunas bacterias cultivables desempeñan un papel importante para satisfacer las necesidades en la degradación de residuos y la reproducción de H. illucens.
Alcaloides en bulbos de Hippeastrum miniatum y su actividad inhibitoria de la colinesterasa como agente terapéutico para el Alzheimer
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Godoy Bautista, Kirianova; Mialhe Mattonier, Eric Louis
Hippeastrum miniatum, es una especie nativa de la selva peruana usada tradicionalmente como antídoto para la mordedura de serpiente. Este trabajo parte de la hipótesis de que H. miniatum posee alcaloides inhibidores de la acetilcolinesterasa y por tanto, podría ser un reservorio de moléculas activas para el tratamiento del Alzheimer. Para corroborar esta hipótesis, se identificaron los alcaloides de los bulbos de Hippeastrum miniatum y se determinó su actividad inhibitoria de la colinesterasa; empleando métodos de alto rendimiento que incluyen docking molecular y técnicas analíticas que integran la cromatografía de capa fina (TLC), bioautografía enzimática y espectrometría de masas en tándem MALDI TOF/TOF. Mediante éstas técnicas, se han identificado satisfactoriamente 11 alcaloides, destacando galanthamine y (+)-8-O-demethylhomolycorine. La actividad anticolinesterasa in sílico, fue evaluada mediante docking molecular. Este análisis reportó la presencia de 7 alcaloides farmacológicamente importantes, capaces de enlazarse al sitio catalítico y al sitio aniónico periférico (PAS) de la enzima. La actividad anticolinesterasa in vitro, arrojó un IC50 de 29.67μg/mL. Para identificar los alcaloides responsables de esta actividad, se ha desarrollado por vez primera, la técnica analítica que integra la bioautografía enzimática por TLC con espectrometría de masas en tándem MALDI TOF TOF fuera de línea. Mediante ésta técnica se determinó que los alcaloides responsables de la inhibición de la acetilcolinesterasa son: pancratinine A, lycorine, clivonidine, galanthamine y (+)-8-O-Demethylhomolycorine. El docking molecular de (+)-8-O-Demethylhomolycorine con la acetilcolinesterasa, muestra que éste se une al sitio catalítico y al PAS de la enzima, con una energía libre de enlace de -8.79 Kcal/mol . Este alcaloide destaca porque además de poseer actividad dual sobre la acetilcolinesterasa, reportes previos muestran que inhibe a la enzima GSK - 3β, responsable de la hiperfosforilación de la proteína Tau. Por tanto, es una molécula multidiana prometedora para el desarrollo de fármacos más eficaces para el Alzheimer.
Identificación molecular de la nutria de río (Lontra longicaudis - Sub familia: Lutrinae) y caracterización metagenómica/metaproteómica de su microbiota fecal y dieta en la Reserva de Biósfera del Noroeste Amotapes-Manglares
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Sanjinez Noblecilla, Laura Yaddira; Cedeño Escobar, Virna Alexia
La nutria de rio (Lontra longicaudis) es considerada un componente importante para los ecosistemas acuáticos al ser un depredador tope, involucrada directamente en cascadas tróficas otorgando mayor complejidad al ecosistema, siendo bioindicadora del buen estado de los ecosistemas en los que habita. La identificación de especies silvestres mediante estudios moleculares es un aspecto importante, desplazando la determinación morfológica y convencional de identificación. Mediante análisis molecular de genes de la región control de ADN mitocondrial pudimos identificar la nutria de río con el 98 al 100% de confianza. La microbiota es esencial para dilucidar el estado salud de especies silvestres, esta se encuentra constituida por microorganismos patógenos y benéficos. La identificación de estos microorganismos asociados a intestino mediante el análisis de heces a través de metagenómica dirigidas al gen ADN ribosómico 16S y mediante la espectrometría de masas permitió conocer a nivel de phylum que los Firmicutes tuvieron mayor abundancia en las muestras QFM1, QFM2 y QAM2, Fusobacteria fue más abundante en QGM2, Proteobacteria estuvo presente mayormente en QGM1 y QAM1, confirmándolo con resultados metaproteómicos. Además, el conocimiento sobre la dieta es un aspecto importante de manejo estudiado para evaluar la disponibilidad de alimento ya que de eso depende su población y distribución geográfica. Para ello se realizó un análisis de la dieta mediante técnicas no invasivas como la metagenómica, dirigido al gen COI (citocromo oxidasa I) y metaproteómica como herramienta potencial para la identificación de dieta nuestros resultados reafirmando que L. longicaudis es una especie generalmente piscívora y generalista resaltando Phylum como Chordata, Artropoda, Ascomicota y Nemátoda y géneros representativos como Bricon, Paniluris, Leporinus, Macrobrachium y Oreochromis. Este estudio preliminar ha permitido caracterizar y mejorar el conocimiento biológico, microbiológico y ecológico de la nutria para contribuir al desarrollo de un plan de manejo para su conservación en el Perú.
Péptidos marcadores en pelo para determinación de especie y metagenómica fecal para la evaluación de dieta y microbiota de Odocoileus virginianus en el CCEA-RBNOAM
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Carrillo Apolo, Geyby Tatiana; Cedeño Escobar, Virna Alexia
La Reserva de Biósfera del Noroeste Amotapes-Manglares (RBNOAM), está localizada en los departamentos de Piura y Tumbes y alberga grandes mamíferos como Odocoileus virginianus, un determinante importante de la biodiversidad y una gran cantidad de servicios ecosistémicos. Los venados generalmente se ubican en áreas de difícil acceso y debido a su alto grado de estrés son difíciles de estudiar en estado silvestre, por lo que la aplicación de técnicas moleculares con uso de marcadores genéticos y proteómicos a partir de muestras no-invasivas surgen como una excelente alternativa, en ese sentido los objetivos de la presente investigación fueron obtener mediante espectrometría de masas MALDI TOF/TOF marcadores peptídicos de especie en pelo de O. virginianus, y por otro lado determinar su dieta y microbiota a través de metagenómica dirigida a 16S y RBCL en muestras fecales tomadas entre mayo (estación lluviosa) y noviembre (estación seca) del 2019. Los resultados de shotgun proteomics mostraron que los péptidos de alfa-queratina fueron dominantes en el análisis, estas se compararon con secuencias de otros mamíferos depositadas en bases de datos disponibles online, hallándose dos péptidos específicos para O. virginianus, mientras que el resto complementa la identificación taxonómica. Por otro lado, la microbiota fecal mostró que proteobacteria, bacteroidetes y firmicutes fueron dominantes en ambas estaciones, con géneros relacionados con la capacidad de obtención de nutrientes de material vegetal consumido, así mismo, la evaluación de la dieta mostró que la familia fabaceae fue la más consumida, y se determinó una mayor diversidad de familias en la época lluviosa que en la seca. Estos resultados muestran la eficiencia del uso de muestras no invasivas, y las herramientas moleculares en la obtención de información que permita la gestión para la conservación no sólo de O. virginianus, sino del ecosistema en el que se encuentra dada su importancia en los procesos y vías sucesionales.
Caracterización genómica, proteómica y metabolómica de Hylocereus spp y Echinopsis spp (CACTACEAE).
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Chang Coronado, Rosita Mercedes; Mialhe Matonnier, Eric Louis
La familia Cactaceae, es un gran grupo de plantas suculentas muy diversas y de amplia distribución en América. Tiene una gran importancia ambiental, socio-cultural y económica destacando los géneros Hylocereus y Echinopsis, como productores de flavonoides y alcaloides, respectivamente. En Perú, la identificación de Cactáceas se adjudica sólo a nivel taxonómico y la evaluación de sus compuestos bioactivos está limitado solo a conocimientos etnobotánicos y medicina tradicional. Por lo tanto, estudios locales a nivel genómico, proteómico y metabolómico en Cactáceas es poco conocido. Para el estudio genómico (código de barras de ADN) se diseñaron primers para amplificar la región ITS2. Para el estudio proteómico, se estandarizó un protocolo de extracción de proteínas totales para un análisis de shotgun proteomics y búsqueda de base de datos para el mapeo de péptidos por homología. Y para el estudio metabolómico, se estandarizó un protocolo de extracción de metabolitos incluyendo etapas de meceración/sonicación y separación mediante cromatografía de capa fina (CCF) para un análisis por espectrometría de doble masa (MALDI TOF/TOF). La secuenciación parial a partir de la región ITS2, se obtuvo una identidad del 100% en muestras de Hylocereus monacanthus, así como en especies de Echinopsis. El análisis shotgun proteomics, permitió identificar un total de 133 proteínas para H. monacantus, mientras que 19, 15, 37 y 64 proteínas fueron identificadas para E. pachanoi, E. pachanoi var. cristata, E. peruvianus y E. santaensis, respectivamente, Las proteínas identificadas en ambos géneros fueron clasificadas de acuerdo a sus procesos biológicos, conferidos principalmente a proteínas relacionadas con crecimiento y desarrollo, energía, metabolismo, respuestas de defensa abiótica y biótica, enzimas de biosíntesis de diversas sustancias, entre otras. En el análisis de metabolitos, se identificaron ácido glutámico, biotina y miricetina de extractos de pulpa y cáscara de frutos de pitahaya fucsia y amarilla. Además, se determinaron los primeros perfiles MS/MS de mescalina en cuatro especies de Echinopsis. En conclusión, mediante código de barras de ADN se logró identificar las especies del género Hylocereus y Echinopsis usando la región ITS2 como marcador para la identificación molecular, además el análisis proteómico y metabolómico, nos mostró la complejidad de moléculas de los procesos interactivos planta-microbioma-ambiente de ambos géneros en estado silvestre.
Análisis transcriptómico y proteómico de la biosíntesis de glucósidos esteviol y perfil metabolómico en Stevia rebaudiana
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Bazán Sernaqué, Pilar Del Milagro; Mialhe Matonnier, Eric Louis
Stevia rebaudiana es un arbusto herbáceo perenne, pertenece a la familia Asteraceae, nativo del sur de América endémica de Amambay – Paraguay. Su importancia en el mercado radica por presentar edulcorantes no calóricos 200 a 300 veces más dulce que la sacarosa, importante en el campo médico e industrial. El objetivo de la investigación fue integrar tecnologías omicas (Transcriptómica, proteómica y metabolómica) en plántulas de Stevia rebaudiana. Nuestros resultados mostraron a nivel de transcriptoma la expresión de tres genes de interés en la síntesis de glucósidos esteviol UGT74G1, UGT76G1 y UGT85C2, teniendo una mayor expresión UGT76G1 el cual particularmente participa en la síntesis de Rebaudiosido A; así también la EM-MALDI TOF/TOF permitió la identificación de secuencias peptídicas de enzimas UGT76G1, UGT85C2, UGT71E1 y UGT73E1 mismas que participan en la síntesis de glucósidos esteviol. Finalmente el análisis metabolómico mediante Cromatografía de capa fina acoplada a EM-MALDITOF/TOF a partir de hojas frescas mostró diversos metabolitos como flavonoide, diterpenos, triterpenos y alcaloides. Pocos son los estudios de integración de tecnologías modernas en plantas no modelo como en Stevia rebaudiana siendo de importancia para programas futuros de mejoramiento en esta especie.
Análisis metabólico mediante espectrometría de masas MALDI TOF TOF de plántulas de Hylocereus sp (PITAHAYA) sometidas a diferentes condiciones de estrés biótico y abiótico
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Quispe Medina, Eugenia Rocio; Mialhe Matonnier, Eric Louis
Las plantas que pertenecen a la familia de las cactáceas hoy en día tienen especial importancia por ser especies que se adaptan a diferentes condiciones agroecológicas, siendo la pitahaya (Hylocereus sp.) un género prominente importancia en la actualidad. El metabolismo a nivel celular de las plántulas de pitahaya que ha sido previamente sometida a diferentes condiciones de estrés, nos ha permitido identificar metabolitos de gran importancia mediante la técnica de espectrometría de masas MALDI TOF TOF, estos compuestos son de gran importancia para diferentes industrias; estas condiciones fueron el estrés biótico, con bacterias promotoras de crecimiento vegetal como Psedomona putida y Rhizobium sp. se encontraron metabolitos pertenecientes a flavonones, flavonoides, Hydroxichalconas, terpene lactones, Tricarboxyllic, alkaloide, diterpenoide, terpenoides. Por otro lado, cuando las plántulas de pitahaya fueron sometidas de a condiciones de estrés por radiación ultravioleta (UV) se encontraron los metabolitos pertenecientes a terpene lactone, diterpenoide, flavonoide, isoflavan, isoflavonoides, dihidrochalcona, alkaloids, Withalanoides, y monoterpenoides. Key
Identificación, caracterización y evaluación de propiedades antimicrobianas y antitumorales de metabolitos obtenidos en Moringa oleifera, Spondias mombin, Neoperuvianos sp., Caesalpinia spinosa y Achyrocline peruviana
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Paredes Cerna, Margarita Licet; Mialhe Matonnier, Eric Louis
El Perú es un país megadiverso, poseedor de una gran diversidad y riqueza vegetal las cuales la mayoría de ellas son una fuente importante en la búsqueda de fármacos para el tratamiento de una serie de enfermedades. En este estudio se evaluó la actividad antimicrobiana y antitumoral de cactus y plantas medicinales del norte del Perú. Se identificó y caracterizo metabolitos de interés mediante espectrometría de masas MALDI TOF/TOF, presentes en extractos de Moringa oleifera, Spondias mombin, Neoperuvianos sp., Caesalpinia spinosa y Achyrocline peruviana. Mediante el análisis de m/z obtenida por MALDI TOF-TOF y su procesamiento en la base de datos SOFTWARE MS FINDER, se logró identificar metabolitos secundarios con múltiples propiedades en el tratamiento de enfermedades. Destacando Justicidina, Isovitexina conocidos por tener actividad anticancerígena. Por otra parte, los extractos etanólico y metanólico evaluados, mostraron actividad antibacteriana frente a cepas patógenas y actividad antitumoral en las líneas celulares HCT-8 y glioblastoma humano U-251. Esta investigación es importante para relacionar los efectos benéficos de los metabolitos secundarios en el campo de la salud.
Aplicación de técnicas ómicas en la evaluación de cepas probióticas en el cultivo de Thalassiosira weissflogii para mejorar el cultivo larvario de Litopenaeus vannamei
(Universidad Nacional de Tumbes, 2020) Sernaqué De La Cruz, Verónica Inés; Quimi Mujica, Juan Gerardo
La biotecnología de microalgas recientemente ha obtenido gran impacto, por sus valiosos componentes como lípidos y metabolitos; y su aplicación como fuente de alimento en la larvicultura. El cultivo de microalgas, así como de rotíferos y artemia, pueden albergar altas concentraciones de bacterias patógenas causando severas pérdidas en el sector langostinero. En la presente investigación se utilizó un consorcio de cepas probióticas inoculadas al cultivo de Thalassiosira weissflogii, se evaluó la concentración celular mediante curva de crecimiento (cel/ml); al consorcio de cepas probióticas se realizó análisis proteómico y metabolómico mediante espectrometría de masas-MALDI TOF TOF. Para el cultivo de Thalassiosira se realizó análisis metagenómico por la técnica de secuenciamiento PGM ion Torrent, proteómico y lipidómico; y para el cultivo larvario de Litopenaeus vannamei se aplicó metagenómica y análisis de producción del ciclo larvario alimentado con el cultivo de Thalassiosira enriquecida con el consorcio de cepas probióticas (Th-Cp). Los resultados obtenidos en la concentración celular del cultivo Th-Cp, fue mayor en comparación al control ThC, además la prueba de producción del ciclo larvario demostró un mayor porcentaje de sobrevivencia del 58.5% en tanques alimentados con Th-Cp con respecto al control 43%; además se encontró péptidos antimicrobianos presentes en el consorcio como son bacilysin, subtilyn y surfactin y metabolitos como bacitracin que ayudan a proteger el cultivo de microalgas y por ende al cultivo larvario; el análisis proteómico de Th-C detecto secuencias peptídicas para el género Vibrio, y el análisis metagenómico confirmo la presencia Vibrio en el cultivo masivo CM-Th-C en un 49.1% en comparación con 0.3% de CM-ThCp, en el análisis lipídomico se detectó ácidos grasos de cadena larga y corta en ambos cultivos Th-C y Th-Cp. Por lo tanto, las aplicaciones tecnológicas en la interacción bacteria-microalga es un paso importante en el desarrollo futuro de la acuicultura sostenible.

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